A partir de 1502, os europeus iniciaram as primeiras ocupações na região, com destaque para a atuação dos padres jesuítas. Estes se preocupavam em estabelecer missões e catequizar as populações indígenas, além de ajudar na organização e ocupação do território. A principal preocupação dos europeus era ocupar os espaços do estuário, uma área estratégica devido à sua proximidade
com o mar e à facilidade de acesso às riquezas naturais.
Além disso, houve uma busca constante por minério de ouro, o que levou à realização de diversas expedições. Em 1526, Francisco Chaves, em busca da lendária trilha do Peabiru, percorreu vastas regiões em busca de riquezas. A mineração, que começou a se expandir ao longo do Rio Ribeira de Iguape, logo avançou para os rios que desaguam na Baía de Paranaguá, aumentando a pressão sobre o território.
A chegada de Martim Afonso de Souza, em 1531, trouxe consigo um novo conflito. Ao tentar estabelecer um núcleo de colonização, ele se desentendeu com os europeus já presentes na região do estuário. Esse desentendimento resultou no primeiro grande conflito armado na região, conhecido como a "Guerra de Iguape", que eclodiu em 1536. A guerra se estendeu até São Vicente, refletindo a disputa entre colonizadores portugueses pela exploração e controle do território.